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Western-blot 實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟及試劑選擇指南

 更新時(shí)間:2017-10-19 點(diǎn)擊量:5943

Western,也稱(chēng)Western blot、Western blottingWestern印跡,是用抗體檢測(cè)蛋白的常用的方法之一。本文分別介紹western 的實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟以及試劑選擇指南。  

 

實(shí)驗(yàn)原理:

Western技術(shù)是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳后,經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

  

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.收集蛋白樣品

用適當(dāng)?shù)牧呀庖禾幚碣N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。某些特定組分的蛋白的蛋白抽提,請(qǐng)欣博盛為您查詢(xún)。  

廠家

貨號(hào)

中文名稱(chēng)

英文名稱(chēng)

規(guī)格

Millipore

2140

總蛋白抽提試劑盒

total protein extration

EA

Acitve Motif

40010

核蛋白抽提試劑盒

Nuclear Extract Kit

100rxns

Biovision

K266-100

核蛋白/胞漿蛋白抽提試劑盒

Nuclear/Cytosol Fractionation Kit

100rxns

K256-100

K256-100

線粒體蛋白/胞漿蛋白抽提試劑盒

Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit

100rxns

 

 

收集完蛋白樣本后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。 

 

廠家

貨號(hào)

中文名稱(chēng)

英文名稱(chēng)

規(guī)格

Merck

71285-3

BCA蛋白定量試劑盒

BCA PROTEIN ASSAY KIT

EA

Acitve Motif

15001

蛋白定量試劑盒

ProStainTMProtein Quantification Kit

1000rxns

 

 

2. 電泳

2.1 SDS-PAGE凝膠配置

2.2 樣本處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。

2.3 上樣與電泳

冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小。

通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況,預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

 

3. 封閉

轉(zhuǎn)膜完畢后,立即將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中,漂洗1-2分鐘,以洗掉膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液,加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體,4封閉過(guò)夜。

 

4. 一抗孵育

吸盡封閉液,加入稀釋好的一抗,室溫?fù)u床上孵育1小時(shí)或者4孵育過(guò)夜。Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照。通常選用TubulinActin抗體,進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。

一抗欣博盛推薦Genetex抗體,GeneTex抗體所含蓋的領(lǐng)域從神經(jīng)學(xué)、血液血管學(xué)、免疫學(xué)、代謝機(jī)制、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、干細(xì)胞研究、老化、遺傳學(xué)、感染疾病診斷與研究,乃于斑馬魚(yú)模式動(dòng)物抗體等,并提供完善的客制化抗體制備服務(wù)。目前該公司擁有的抗體總數(shù)已逾55,000種,而且每月仍有近百種新型抗體推出。其中,以小鼠單株抗體與兔多株抗體為該公司質(zhì)量與價(jià)格優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)品。鏈接如下:www.genetex。。com。有詳細(xì)的各個(gè)領(lǐng)域的研究資料。

 

如需訂購(gòu)請(qǐng)Genetex總代理欣博盛。 

 

廠家

貨號(hào)

中文名稱(chēng)

英文名稱(chēng)

規(guī)格

Genetex

GTX100313

內(nèi)參抗體

beta Actin antibody

100 μl

Neobioscience

NBL02c

內(nèi)參抗體

Anti-β-Actin 單克隆抗體

50ml

Genetex

GTX37298

核蛋白內(nèi)參抗體

Histone H3.1 antibody

 

50μl

Genetex

GTX62983

核蛋白內(nèi)參抗體

Histone H2A.X antibody

 

100μl

Genetex

GTX30202

膜內(nèi)參蛋白

NaK ATPase antibody

 

50μl

 

 

5. 二抗孵育

吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或者4搖床上孵育1小時(shí)。SouthernBiotech能夠提供多種不同標(biāo)記的二抗。 

 

廠家

貨號(hào)

中文名稱(chēng)

英文名稱(chēng)

規(guī)格

Genetex

GTX213110-01

抗兔二抗

Rabbit IgG antibody (HRP)

 

1ml

Genetex

GTX27125

抗山羊二抗

Goat IgG antibody, pre-adsorbed (HRP)

100μl

Southern

Biotech

4030-05

抗兔二抗

Goat Anti-Rabbit IgG-HRP

1ml

Southern

Biotech

1034-05

抗小鼠二抗

Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Rat ads-HRP

100μl

Neobioscience

ANM02-4

抗小鼠二抗

 

兔抗小鼠IgG (H+L)

100μg

Neobioscience

ANR02-1

抗兔二抗

山羊抗兔IgG-HRP

100μl

 

6. 蛋白檢測(cè)

6.1 ECL化學(xué)發(fā)光,顯影,定影

AB兩種試劑在離心管中等體積混勻;1 min后,將溶液平鋪在膜蛋白面,暗室反應(yīng)2min后去盡殘液,包好,放入X-光片夾中。在暗室中顯影定影。

6.2 凝膠圖像分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值以及他們的比值。

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