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各種轉(zhuǎn)染試劑的中文說明

 更新時(shí)間:2022-04-18 點(diǎn)擊量:2399

各種轉(zhuǎn)染試劑中文說明

 

一、PEI Prime Powder, Transfection Grade Linear Polyethylenimine(Serochem)轉(zhuǎn)染步驟(以 HEK293 貼壁細(xì)胞為例)

1.細(xì)胞接種:細(xì)胞密度 2-6 x106 cells/mL.

2.質(zhì)粒的準(zhǔn)備:在 5%最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中,每 10 6 個(gè)細(xì)胞稀釋1.0 ug pDNA。

3. PEI 的準(zhǔn)備:在 5%最終培養(yǎng)體積的 DMEM 或培養(yǎng)基中,每 10 6 個(gè)細(xì)胞稀釋3.0 ug PEI Prime,混勻通過快速,短暫渦旋或顛倒數(shù)次試管,將 pDNA PEI Prime 溶液混合在一起。

4. 使 pDNA  PEI 的混合物在室溫下靜置 10 分鐘。一邊旋轉(zhuǎn)板,一邊將 pDNA PEI 混合物逐漸滴加到細(xì)胞中。

5.37℃ CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉(zhuǎn)染步驟:


說明:以下步驟適用于在 6 孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞。開始時(shí),每 6 孔培養(yǎng)板使用 0.4ug DNA。盡管 DNA 的量看起來很少,但已足夠用于轉(zhuǎn)染。如果想獲得最高的轉(zhuǎn)染效率,對(duì)每種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件都要進(jìn)行優(yōu)化。

轉(zhuǎn)染前一天,用 5ml 含血清和抗生素的培養(yǎng)基分裝使每 6 孔培養(yǎng)板含 2-8×105細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞類型而定)。在細(xì)胞的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)通常 37℃和 5CO2。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng) 40-80融合。轉(zhuǎn)染時(shí),用 DNA 濃縮緩沖液EC Buffer稀釋 1ug DNA 100ul 總體積DNA pH 7-8 TE Buffer 溶解,DNA 濃度:0.1ug/ul。加入 3.2ul Enhancer, 渦旋 1s 以混合溶液。

重要:請(qǐng)保持 DNA Enhancer 比例恒定。

 注意:質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量會(huì)顯著影響幾個(gè)轉(zhuǎn)染參數(shù)如轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性、以及對(duì)于結(jié)果的解釋。因此,只應(yīng)該使用最高純度的 DNA。室溫(15-25℃)孵育 2-5 分鐘,離心(spin down)幾秒鐘以從管頂去除液滴。DNA-Enhance 混合液中加入 10ul Effectene Transfection Reagent,反復(fù)吸取 5

次或渦旋 10 秒鐘以混合。

注意:沒必要一直把 Effectene Reagent 置于冰上。在室溫中放置 10-15 分鐘不會(huì)改變它的穩(wěn)定性。

室溫下(15-25℃)孵育 5-10 分鐘以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育過程中,從培養(yǎng)板上輕柔地吸出培養(yǎng)液,用 4ml PBS 洗滌一次細(xì)胞。加入1.6ml 新鮮培養(yǎng)液(可以包含血清和抗生素)到細(xì)胞中。加入 0.6ml 培養(yǎng)液(可以包含血清和抗生素)至包含轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染復(fù)合物的 EP 中。吸取兩次以混合,立即將轉(zhuǎn)染復(fù)合物 drop-wise 加入 6 孔培養(yǎng)板的細(xì)胞中。輕搖培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物分布均勻。將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物在它們的正常培養(yǎng)條件下孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間直至轉(zhuǎn)染基因表達(dá)。孵育時(shí)間和由所采用的實(shí)驗(yàn)和所使用的基因決定。

Optional: 大多數(shù)情況下,不需去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然而,如果觀察到細(xì)胞毒性,則需在轉(zhuǎn)染后 6-18 小時(shí)移除 Effectene-DNA 混合物,用 PBS 洗滌一次細(xì)胞, 然后加入 5ml 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí),進(jìn)一步試驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

轉(zhuǎn)染β-gal cat 報(bào)告基因的重組子常在轉(zhuǎn)染后孵育 24-48 小時(shí)以使轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí),在轉(zhuǎn)染后 24-48 小時(shí),將細(xì)胞以 1:5~1:10 傳代至合適的選擇性培養(yǎng)基中。保持細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中直至克隆出現(xiàn)。

注意:我們推薦對(duì)每一細(xì)胞系和使用的抗生素建立一個(gè)致死曲線(劑量-反應(yīng)曲線)。但是一定要記住致死曲線受細(xì)胞密度的影響。

以下步驟有時(shí)是必須的:將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于它們正常的培養(yǎng)液如:不含選擇性抗生素的培養(yǎng)液),然后孵育 1-2 天,然后再加入選擇性培養(yǎng)液。










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