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PCR引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些?

 更新時(shí)間:2023-10-16 點(diǎn)擊量:675

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,因此,PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計(jì)。那么你知道PCR引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)

DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過(guò)序列分析軟件(比如DNAman)比對(duì)(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

二、引物長(zhǎng)度一般在15~30 堿基之間

引物長(zhǎng)度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

三、引物GC 含量在40%~60%之間,Tm 值最好接近72℃

GC含量(composition)過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm 值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

四、引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3 位

如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并,會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

五、引物3′端不能選擇A,最好選擇T

引物3′端錯(cuò)配時(shí),不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當(dāng)末位的堿基為A 時(shí),即使在錯(cuò)配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當(dāng)末位鏈為T(mén) 時(shí),錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低,G、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T 之間,所以3′端最好選擇T。

六、引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計(jì)完成以后,應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST 檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性,就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。

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