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免疫熒光實驗的流程

 更新時間:2024-03-19 點擊量:445
  免疫熒光技術(shù)是一種建立在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)之上的先進技術(shù)。它基于抗原抗體反應(yīng)的原理,首先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光標(biāo)簽,然后使用這些熒光標(biāo)記的抗體(或抗原)作為探針,用來探查細胞或組織中的相應(yīng)抗原(或抗體)。通過熒光顯微鏡,可以清晰可見熒光信號在細胞或組織中的位置,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、分布以及通過定量技術(shù)(例如流式細胞儀)來測定其含量。這項技術(shù)為科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷提供了強大的工具,使我們能夠深入了解生物分子的相互作用和細胞內(nèi)過程。那么你知道免疫熒光實驗的流程有什么嗎?讓我們一起來看看吧!
  免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。
  一、細胞片制備(通俗的說法是細胞爬片)
  免疫熒光實驗的第一步是準(zhǔn)備細胞片,而細胞片的質(zhì)量對整個實驗的成功起著至關(guān)重要的作用。這是因為,如果在細胞片制備過程中發(fā)生細胞掉落或損壞,那么實驗將無法繼續(xù)進行。這一步的關(guān)鍵在于精細處理玻片(Slides或Coverslips)并確保細胞保持活力。只有在這一步驟中細致入微地處理好細胞片,才能為后續(xù)的免疫熒光實驗奠定堅實的基礎(chǔ)。
  具體操作步驟:
  細胞準(zhǔn)備。對單層生長細胞,在傳代培養(yǎng)時,將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數(shù)生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
  二、固定和通透
  最關(guān)鍵的是,必須根據(jù)研究對象的抗原性質(zhì),明智地選擇適用的固定方法。選用正確的固定劑和遵循適當(dāng)?shù)墓潭ǔ绦?,對于獲得出色的實驗結(jié)果至關(guān)重要。這是確保實驗成功的重要一環(huán),因為固定是為了保持抗原的完整性,使其能夠被有效地檢測和分析。
  具體操作步驟:
  固定:根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭毎9潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min。
  通透:使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細胞進行通透處理,以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min。
  三、封閉和抗體孵育
  與其他方法(例如ELISA或Western Blot)的許多步驟相似,免疫熒光實驗的主要區(qū)別在于其使用了熒光標(biāo)記的抗體。因此,在進行該實驗時,必須特別注意避光操作,以保持熒光信號的穩(wěn)定性。此外,抗體濃度的選擇在免疫熒光實驗中可能具有更加關(guān)鍵的意義,因為它會直接影響到實驗結(jié)果的質(zhì)量和解釋。
  具體操作步驟:
  封閉:使用封閉液對細胞進行封閉,時間一般為30min。
  一抗結(jié)合:室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。
  二抗結(jié)合:間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
  四、熒光檢測
  最后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。
  具體操作步驟:
  封片及檢測:滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。
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