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全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)產(chǎn)品介紹

 更新時間:2024-03-21 點擊量:1811

全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)包含LacZ基因,在含有IPTG和X-gal的平板培養(yǎng)基上,可進行藍白斑篩選,適用于平端克隆。

全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)的產(chǎn)品組分包括pEASY®-Blunt Cloning Vector、Control Template、Control Primers、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等,

產(chǎn)品特點:

快速:僅需5分鐘。

簡單:加入片段即可。

高效:陽性率高。

提供氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標(biāo)記,便于根據(jù)實驗選擇篩選標(biāo)記。

測序引物:M13 Forward Primer,M13 Reverse Primer,T7 Promoter Primer。

T7 Promoter用于體外轉(zhuǎn)錄。

Trans1-T1感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率高,生長速度快,確??寺?shù),節(jié)約選時間。

操作方法:

1、PCR產(chǎn)物的制備

(1)引物要求:引物不能磷酸化。

(2)酶的選擇:擴增產(chǎn)物為平端的高保真DNA聚合酶,如FasP/,KD Plus DNA Polymerase。

(3)反應(yīng)條件:為了保證擴增產(chǎn)物的完整性,擴增反應(yīng)需要5-10分鐘后延伸。反應(yīng)結(jié)束后,電泳檢測PCR產(chǎn)物的量和質(zhì)量如果擴增產(chǎn)物有多條帶,建議凝膠回收目的片段。

2、克隆反應(yīng)體系

(1)加入

組分

規(guī)格

PCR Product

0.5-4μl

pEASY®-Blunt Cloning   Vector

1μl





(2)輕輕混合,室溫(20℃-37℃℃) 反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,將離心管置于冰

3、推薦克隆反應(yīng)條件

· 最佳插入片段DNA量

載體與片段摩爾比=1:7

可以粗略地按照“1 kb 20 ng"的比例計算。(如1 kb加20 ng、1.5 kb加30 ng等)

· 最佳載體使用量:1μl

· 最佳反應(yīng)體系:3-5 m,體積不足時可以補充無菌水。

· 最佳反應(yīng)時間

(1)片段長度為0.1-1kb(含1 kb):5-10 min

(2)片段長度為 1-2 kb(含2 kb):10-15 min

(3)片段長度為 2-3 kb(含3 kb):15-20 min

(4)片段長度為3 kb 以上:20-30 min

· 最佳反應(yīng)溫度:25℃,如片段是高GC含量,可以37℃反應(yīng)。(推薦用PCR儀控溫)

4、轉(zhuǎn)化

(1) 加連接產(chǎn)物于50 m 7ans1-T1感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物),輕彈混勻,冰浴20-30分鐘。

(2) 42℃水浴熱激30秒,立即置于冰上2分鐘。

(3) 加250 ml平衡至室溫的SOC或LB培養(yǎng)基,200rpm、37℃培養(yǎng)1小時。

(4) 取8u500 mM IPTG和40 wl 20 mg/mlX-gal混合,均勻地涂在準(zhǔn)備好的平板上,37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。

(5)待IPTG和X-gal被吸收后,取200ml菌液均勻地涂在平板上,在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)(為得到較多克隆,1.500xg離心1分鐘,棄掉部分上清,保留100-150 m,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板)。

產(chǎn)品選購:

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

CB101-01

pEASY®-Blunt Cloning Kit

20 rxns



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