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免疫組化(IHC)SP法,原來如此簡單!

 更新時間:2024-09-23 點擊量:232

免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對其進行定位、定性及相對定量的研究,稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)。

一、SP法步驟

1. SP三步法

脫蠟梯度水化滅活內(nèi)源性過氧化物酶抗原修復(fù)封閉一抗孵育二抗孵育SP反應(yīng)DAB顯色蘇木素復(fù)染常規(guī)脫水透明封片

2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

脫蠟和水化

抗原修復(fù)

滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素

血清封閉

一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間

切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗)

⑦DAB顯色

復(fù)染

脫水透明

封片

二、異常分析

1、非特異性染色

抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。

一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體。

內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織),需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。

非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

⑤DAB孵育時間過長或濃度過高。

⑥PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強著色,在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強非特異性著色。

2、呈陰性結(jié)果

抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索最佳濃度。

抗原修復(fù)不全,對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位,以利于與抗體結(jié)合。

組織切片本身這種抗原含量低。

血清封閉時間過長。DAB孵育時間過短。

細胞通透不全,抗體未能充分進入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

三、重要信息

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