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分離純化蛋白質(zhì)內(nèi)序列分析用肽段的材料與步驟

 發(fā)布時間:2023/7/17 點(diǎn)擊量:1402

材料與儀器

材料與設(shè)備

考馬斯亮藍(lán) G(0.05% 的乙酸-20% 甲醇溶液)

乙酸 (5% 10% 甲醇溶液)

甲醇 (50% 的水溶液和 10% 的水溶液)

SpeedVac 型旋轉(zhuǎn)濃縮器(Savant Instruments,Inc.)

Achromobacter 胰蛋白酶 I〔賴氨酰內(nèi)肽酶;50ng/ul 0.1mol/LTri-HCl(pH9.0)

Tween-200.1% 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0) 溶液〕

UltrafreeTM MC 濾器(22um;Millipore Corp.)

CF3COOH(TFA;0.1% 50% 乙腈溶液)

C18 反相 HPLC (2.1X250 mm;5um,300A)(VYDAC)

乙腈

2-丙醇

步驟


操作流程如下:

1) SDS-PAGE 分離待研究蛋白。

2) 凝膠用 0.05% 考馬斯亮藍(lán) G 染色 15~30 min。

3) 用含 5% 乙酸的 10% 甲醇溶液脫色。

4) 在水中浸泡 10 min。

5) 從凝膠上切下蛋白帶,轉(zhuǎn)移至微量離心管。切下一段不含蛋白質(zhì)的凝膠作對照。如必要,可將凝膠切成較小的碎片,使之能容易地沉入微量離心管的底 部。

6) 各管加入 1 ml 50% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

7) 各管加入1ml 10% 甲醇。室溫下孵育 20 min。棄上清。

8) 凝膠碎片在 SpeedVac 型旋轉(zhuǎn)濃縮器中干燥 2 min。

9) 各管加 10ul Achromobacter 蛋白酶 I

10) 各管加最小體積的含 0.1%Tween-20 0.1mol/L Tris-HCl(pH9.0)—剛夠淹沒凝膠碎片即可。
注:凝膠碎片會膨脹, 故重要的是要保證它們?nèi)阅苎蜎]在含去垢劑的緩沖液中。

11) 各管 30℃ 孵育 24 小時。

12) 各管在微量離心機(jī)中離心,將各管上清轉(zhuǎn)移至 22-um Ultrafree MC 濾器內(nèi)。12000r/min 離心 2 min。保留濾液。

13) 1 體積含 0.1%TFA 50% 乙腈溶液于各管留下的凝膠碎片中--足夠淹沒凝膠碎片。4°C 孵育 30 min。

14) 重復(fù)第 1213 步操作。合并各樣品的濾液。

15) 樣品在 SpeedVac 型旋轉(zhuǎn)濃縮器中旋轉(zhuǎn)濃縮至體積小于 100 ml。加適量 HPLC 平衡液,制成供 HPLC 分析用的樣品。

16) 用反相 HPLC C18 柱分離消化液中的肽段。用含 0.09% TFA 的乙腈/2-丙醇 (3:1) 梯度洗脫肽段。于 214mn(對肽鍵)和 295nm(對色氨酸)檢測肽段的 UV 吸收。


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